當(dāng)細(xì)胞生物學(xué)家第一次發(fā)現(xiàn)可能有一種脂質(zhì)參與他們最喜歡的途徑時(shí)，這有點(diǎn)像在馬路對(duì)面找到一堵墻(就像當(dāng)脂質(zhì)學(xué)家在他們的路上找到一種蛋白質(zhì)一樣……)。

      由于脂質(zhì)的不同性質(zhì)，大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)家都害怕在他們的研究過(guò)程中不得不面對(duì)這種情況。好消息是，有一些簡(jiǎn)單的方法可以幫助克服這一障礙，使研究特定途徑中的脂質(zhì)變得更容易。在這里，我想介紹一些脂配體相互作用研究的分析和準(zhǔn)備工具。

1 覆蓋試驗(yàn)Overlay assays-鑒定與給定蛋白質(zhì)相互作用的脂質(zhì)

      這些分析方法允許鑒定一種或多種脂質(zhì)與給定蛋白質(zhì)相互作用。

      與Western-blot原理類似，它們的原理是在表面涂上各種類型的脂質(zhì)，這些脂質(zhì)將與已知的蛋白質(zhì)接觸，這種蛋白質(zhì)將被標(biāo)記或抗體臨時(shí)檢測(cè)到。脂質(zhì)的載體通常是硝化纖維素膜(圖1)。與點(diǎn)印跡法一樣，需要優(yōu)化一些實(shí)驗(yàn)參數(shù)(如緩沖液、蛋白質(zhì)純化或蛋白質(zhì)濃度)。

      當(dāng)可用蛋白質(zhì)的數(shù)量有，小的“覆蓋分析格式"可以用少于0.5 mg的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。這是一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)測(cè)試一種感興趣的蛋白質(zhì)對(duì)各種脂質(zhì)的結(jié)合能力!

2 下拉試驗(yàn)Pull-down assays-發(fā)現(xiàn)一種已知脂質(zhì)的蛋白質(zhì)伙伴

      對(duì)于相反的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，當(dāng)您想要識(shí)別已知脂質(zhì)的蛋白質(zhì)伴侶時(shí)，瓊脂糖為基礎(chǔ)的下拉試驗(yàn)等制備技術(shù)將是您的選擇:

*瓊脂糖珠包被確定的脂質(zhì)可以被進(jìn)一步孵育與細(xì)胞裂解液，上清液，重組蛋白…

* 然后相互作用的復(fù)合體通過(guò)離心將它們拉下來(lái)。

       它允許分離脂質(zhì)結(jié)合蛋白的數(shù)量適合進(jìn)一步鑒定和表征。它經(jīng)常與細(xì)胞裂解液一起用于“撈出"脂質(zhì)對(duì)偶物(圖4)。

3 漂浮試驗(yàn)Floatation assays-用于更高特異性的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用

       當(dāng)你在尋找更高特異性的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用時(shí)，另一種基于脂質(zhì)富集脂質(zhì)體(用作脂質(zhì)/配體相互作用的基質(zhì)支持)的制備方法是可用的。

       與GEM脂筏提取(葡萄糖梯度超離心)類似，脂質(zhì)體預(yù)結(jié)合到脂質(zhì)配體上，將沿著超離心制備的葡萄糖梯度分成幾個(gè)部分分布(圖5)。

這些富脂脂質(zhì)體有許多優(yōu)點(diǎn):

*聚脂質(zhì)體PolyPIPosomes是聚合的脂質(zhì)體，

*增加穩(wěn)定性(長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月)，

*生物素標(biāo)簽，方便鏈霉親和素檢測(cè)，

*尺寸均勻(~200 nm)，可進(jìn)行浮選試驗(yàn)，

*這些脂質(zhì)體也可用于:表面等離子體共振，脂質(zhì)體覆蓋分析，ITC。

        想知道更多，讓你的生活更輕松，以防你偶然發(fā)現(xiàn)“可怕的脂質(zhì)"嗎?

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默瑞生物

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